一种新型重组抗体导向溶栓剂的体外溶栓研究

　　一种新型重组抗体导向溶栓剂的体外溶栓研究

　　一种新型重组抗体导向溶栓剂的体外溶栓研究

　　中国免疫学杂志 2000年第4期第16卷 分子与细胞免疫学

　　作者：万海英　刘征辉　顾津明　朱明清　李佩霞　阮长耿

　　单位：万海英(苏州医学院 附属第一医院江苏省血液研究所血栓与止血研究室，苏州 215006);刘征辉(苏州医学院 附属第一医院江苏省血液研究所血栓与止血研究室，苏州 215006);顾津明(苏州医学院 附属第一医院江苏省血液研究所血栓与止血研究室，苏州 215006);朱明清(苏州医学院重点实验室，苏州 215007)

　　关键词：活化血小板;单抗;单链尿激酶;基因表达;导向溶栓

　　摘　要　目的：探讨一种新型重组融合基因抗体导向溶栓剂SZ51Hu-scuPA的体外溶栓效力。方法：通过转瓶扩大生产获得的大量 基因重组融合蛋白SZ51Hu-scuPA，通过抗体竞争结合实验确定融合蛋白的抗体亲和力;进 而与尿激酶进行不同浓度血小板血浆凝块体外溶栓比较。结果：该融合 蛋白体外纤溶活性为39 000 U/mg;其抗体亲和力是鼠源性单抗的67%;体外溶栓效力较uPA 提高4.1～8.4倍。结论：体外溶栓结果证明，融合蛋白SZ51Hu-scuPA 既兼有与人活化血小板结合特性又有纤溶酶原激活剂特性的双功能分子，是一种新型的抗体 导向溶栓剂。

　　中国图书分类号　 R73-354

　　Study on thrombolysis of a new recombinant ant ibody-targeted plasminogen activator in vitro

　　WAN Hai-Ying　LIU Zheng-Hui　GU Jing-Ming

　　(Jiangsu Institute of Hematology,the First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215006)

　　Abstract　Objective：To compare the thrombolytic propertie s in vitro between urokinase(uPA) and the recombinant chimeric plasminogen activ a tor SZ51Hu-scuPA,which was composed of a humanized monoclonal antibody SZ51(SZ5 1 Hu) specifically against activated human platelet and a single-chain urokinase( scuPA).Methods:The fusion protein SZ51Hu-scuPA was produc ed from the supernatant of a stable myeloma cell line growing in spinner flask,a nd then purified by chromatography on a GAH IgG-Sepharose 4B affinity column.Th e binding capacity to activted human platelet of purified fusion protein SZ51Hu -scuPA was obtained by antibody competitive binding assay.The thrombolytic acti vity was determined by lysis of 125I-fibrin-labelled human plasma cl ots.Results:SZ51Hu-scuPA affinity was 67% of the SZ-51M an d the fibrinolytic activity was 39 000 U/mg. The lysis of the clots by SZ51Hu-s c uPA was 4.1～8.4 fold more potent than uPA.Conclusion:Th e fusion protein SZ51Hu-scuPA was more competent to dissolve platelet clots than uPA and it was a new recombinant antibody-targeted plasminogen activator in vit ro.

　　Key words　Activated platelets 　Monoclonal antibody　Si ngle-chain urokinase　Gene expression　Targeting thrombolysis

　　抗人活化血小板GMP-140单抗SZ-51(SZ-51M)，经放射性核素99mTc标记后(99mTc-SZ51)不仅在实验性狗股动、静脉血栓模型中，而且在人 体内血栓显像中都显示了良好的显像效果[1]，证明了其血栓导向能力 。与尿激酶的化学偶联产物体外溶栓率较单用尿激酶提高了3～5倍[2]。本研究对通过基因工程方法获得的分泌重组SZ51Hu-scuPA抗体导向溶栓剂[3]的阳性细胞克隆进行了体 外扩大培养，应用亲和层析技术纯化SZ51Hu-scuPA融合蛋白，与uPA对125I标记纤维 蛋白原的不同血小板血栓凝块在体外进行了溶栓比较，以期得到一种新型的基因工程抗体导 向溶栓剂。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验材料　人尿激酶纯品由南京大学制药厂朱长生教授惠赠，比活为155000 U/mg;人纤维蛋白原购自Sigma公司;重组SZ51Hu-scuPA的SP2/0细胞株由本室保存。

　　1.2　实验方法

　　1.2.1　细胞扩大培养　最初接种采用集合多个小方瓶培养的细胞，弃上清 ，以1×105 ml-1细胞密度接种于转瓶(500 ml玻璃转瓶及搅拌动力系统为Bellco公 司产品)， 再次接种时可从生长细胞的转瓶内直接取细胞进行接种。培养基为RPMI1640，补加葡萄糖至 4.5 g/L,置CO2培养箱，37 ℃培养，调节转瓶内转子旋转速度为20 r/min，待细胞停止生长后，继续培养12～24 h，离心收集上清，-70 ℃储存备用。

　　1.2.2　亲和层析纯化SZ51Hu-scuPA　应用GAH IgG-Sepharose 4B亲和层 析柱纯化SZ51Hu-scuPA重组融合蛋白。SZ51Hu-scuPA融合蛋白中相关IgG和相关scuPA抗原 定量采用ELISA或RIA法，scuPA酶活性单位定量采用纤维蛋白平板法[4]。

　　1.2.3　鼠源性单抗SZ-51(SZ-51M)和纤维蛋白原的125I标记　采用 Iodogen法[5]标记蛋白。经20%三氯醋酸沉淀法测得标记率为96%～98%。纤维蛋 白原标记125I(125I-Fg)后的可凝蛋白百分比测定，取5 μl 125 　I-Fg ，加入0.5 ml人血浆，再加入过量凝血酶，37 ℃放置30 min，离心弃上清，测定凝块的放 射性计数。由凝块的放射性计数/加入125I-Fg总放射性计数×100% 计算得可凝蛋白百分比为96%。

　　1.2.4　SZ-51Hu-scuPA与SZ-51M的抗体竞争结合试验　于经凝血酶活化 的 血小板中加入等体积0.25%戊二醛，室温下固定1 h，0.3% BSA-PBS重悬，计数血小板 。取5× 107血小板加入125I-SZ51M(5×104 cmp,0.65 μg/ml)和不同浓度(20.8 μg/ml 倍比稀释)的未标记SZ-51Hu-scuPA纯品，阴性对照为SZ-2(抗血小板GPIb单抗)，总体积1 00 μl，37 ℃反应2 h，用0.01 mol/L,pH7.4的PBS缓冲液洗涤两次，测定血小板沉淀物的 放射性计数，计算结合率。

　　1.2.5　不同浓度血小板血浆凝块的血栓制备　取健康供血者新鲜全血(3.8% 枸橼酸三钠1∶9抗凝)，分离PRP血浆(2.5×105血小板/μl);PPP血浆(1×104 血小板 /μl) ;再富集PRP血浆(R-PRP：12×105 血小板/μl)。分别向PRP、PPP和R-PRP血 浆中按下 列顺序加入125I-Fg(终浓度500 000 cpm/ml)，CaCl2(终浓度0.05 mol /L)，凝血酶(终浓度1 U/ml)，混匀后立即吸入内径3.5 mm的硅胶管内，37 ℃静置30 mi n，将含有凝块的硅胶管切成1.5 cm长的小段(约含0.12 ml血浆)，取出不同血小板浓度的血 栓凝块(分别称为PPP、PRP、R-PRP血栓)，用0.9% NaCl 3 ml洗涤2次，弃上清后对血栓做 总放射性计数，于每只栓子中加入1 ml PPP血浆。

　　1.2.6　体外溶栓　取上述制备的含有PRP、PPP和R-PRP3种血栓的血浆， 再分成4组：生理盐水组、尿激酶组、尿激酶与SZ51M等摩尔混合组(uPA+SZ51M)以及SZ51Hu -scuPA融合蛋白组。每组分别加入终浓度10、20和50 U/ml酶活性单位的溶栓剂1 ml， 设3个平行管进行溶栓试验。置37 ℃温箱溶栓1、2、4和24 h，各点分别取出100 μl上 清做放射性计数。溶栓率=血浆中放射性计数/溶栓前栓子的总放射性计数×100% 。

　　1.2.7　纤维蛋白原浓度测定　按Kit说明书进行(纤维蛋白原测定Kit为Stag o公司产品)。

　　2　结果

　　2.1　SZ51Hu-scuPA的纯化　采用GAH IgG-Sepharose 4B 亲和层析方法对 收集的转瓶1 L上清进行纯化得纯品3 mg左右。酶活性为39 000 U/mg总蛋白。

　　2.2　SZ51Hu-scuPA与SZ-51的竞争结合试验　125I标记SZ-51M与 未标记的融合蛋白SZ51Hu-scuPA与活化血小板保温后，融合蛋白显示出和SZ-51M有 竞争结合活化血小板的剂量依赖性效应　(图1)。　当125I-SZ-51M与血小板的结合率下 降了一半，即被加入的融合蛋白抑制了50%，此时融合蛋白IgG的加入量为0.98 μg/ml，而 125 I-SZ-51M为0.65 μg/ml。

　　图1　 125I标记鼠源性单抗SZ51与未标记融合蛋白

　　SZ51Hu-scuPA之间竞争结合人活化血小板

　　Fig.1　Competitive binding between 125I-mouse SZ51 and

　　nonl abelled fusion protein SZ51Hu-scuPA towards human activated platelets

　　2.3　体外溶栓效率　为了比较融合蛋白的溶栓效率，我们以不同浓度的血小板制备血栓，在10、20和50 U/ml 3种溶栓剂量(阴性对照组为生理盐水，阳性对照组为u PA和uPA+SZ51M)下，测定不同时间(1、2、4和24 h)的溶栓效率。表1列出了3种浓度血小 板的血栓(PPP：1×104血小板/μl;PRP：2.5×105血小板/μl及R-PRP：12×105血 小板/μl)在不同剂量、不同时间的溶栓结果。显示在PPP组除阴性对照组无变化外， 阳性对照组在溶栓4 h后，溶栓效率呈增高趋势，而SZ51Hu-scuPA在所有剂量下 溶栓1 h即产生较高的溶栓效率，2 h比相同剂量的阳性对照组的溶栓率高7.2倍，4 h已接近 完全溶栓。PRP中阳性对照组只在4 h才显示出溶栓，其它时间的所有剂量组的溶栓率均在 10%左右。然而SZ51Hu-scuPA 10 U/ml时，溶栓4 h后，溶栓率在21%;20 U/ml时，2 、4 h溶栓率分别达17.1%及39.3%;而50 U/ml时溶栓率在1 h就已达44.1%，24 h各剂量组 的溶栓率均达完全。在R-PRP组的溶栓情况与PRP组基本一致，只是在高剂量组( 50 U/ml)时的溶栓率略低于PRP组。另外，在各溶栓剂量组的溶栓过程中，纤维蛋白原的浓 度均未发生改变[(2.5±0.2) g/L]，只有剂量为50 U/ml、溶解PPP血浆凝块时略有降低(0 .96 g/L)。

　　表1　重组抗体导向溶栓剂SZ51-scuPA与 uPA、uPA+SZ51M及

　　生理盐水体外溶解125I标记的人血浆凝块的特征

　　Tab.1　Thrombolytic properties of SZ51-scuPA,uPA,uPA+SZ5 1M

　　and saline towards 125I-labelled human plasma clots immersed in human plasma in vitro

　　Time(h)124241242412424

　　Plasminogen activatorPPP(Fibrinogen g/L)PRP(Fibrinogen g/L)R-PRP

　　Clot lysis(%)

　　0.9%NCl3.55.64.9(2.7)4.63.93. 43.9(2.7)4.62.93.04.21.2

　　10 U/ml

　　uPA10.912.914.5(2.3)45.310.211.910.0(2.7)55.85.02.95.725.0

　　uPA+SZ51M7.214.312.0(2.6)42.112.512.610.0(2.7)49. 23.24.26.022.2

　　SZ51Hu-scuPA37.555.165.9(2.2)100.07.410.121.0(2.7)100.06.611.920.4100.0

　　20 U/ml

　　uPA12.712.916.1(2.3)55.012.212.012.2(2.7)61.61 .74.24.832.1

　　uPA+SZ51M11.011.617.8(2.5)55.211.513.111.9(2.6)55.22.02.65.530.0

　　SZ51Hu-scuPA56.560.977.8(2.2)10010.017.139.3(2.6)100.0[ ]12.119.740.3100.0

　　50 U/ml

　　uPA10.011.623.1(2.2)78.510.612.612.7(2.6)77.53.0 4.96.628.0

　　uPA+SZ51M8.912.129.0(2.8)83.08.010.111.5(2.6)[ ]73.22.34.37.835.0

　　SZ51Hu-scuPA61.883.993.4(1.0)100.044.150.046.9(2.6)100.018.531.141.9100.0

　　Note:The results in the table were the mean value from 3 experiments( ±s).The area of s was ±1.0～1.4(lysis of the clots was<10%);±1.5～2.5(lysis of th e clots was 11.0%～14.5%);±4.6～7.6(lysis of the clots was 16.1%～36.0%);±8.1 ～15.2(lysis of the clots was>39.3%)3　讨论

　　我们通过转瓶扩大培养、亲和层析获得了SZ51Hu-scuPA 纯品，基本上保留了原亲本抗体的 亲和力(是鼠源性单抗SZ-51M的67%)，酶活性为39 000 U/mg总蛋白。在溶解3组含不同 血 小板浓度的人血浆凝块时，SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓效率明显高于单用uPA的组的溶栓 效 率，最高分别达7.4倍(PPP血浆凝块)、4.1倍(PRP血浆凝块)和8.4倍(R-PRP血浆凝 块)。随 着血栓中血小板浓度的增高，尽管SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓效率有所下降，但uPA组下 降更为明显，尤其在溶解R-PRP血栓凝块时，uPA组最高剂量点(50 U/ml)在4 h仍未观 察到溶栓迹象，溶栓率与生理盐水组相似，而相同剂量SZ51Hu-scuPA嵌合分子的溶栓率此 时已达41.9%。uPA与SZ51M等摩尔混合组的溶栓结果与uPA组无明显差异。这些结果表明 ，由 于SZ51Hu-scuPA嵌合分子中抗活化血小板单抗SZ51导向血栓的作用，嵌合分子可明显提高 溶栓效率，同时证实活化血小板确实是影响溶栓效率的重要因素。

　　在制备血栓凝块时，我们注意到PPP形成的血栓凝块很疏松，而以R-PRP形成的血栓凝块则 非常紧密，这就导致溶栓剂在溶解PPP血栓凝块比PRP、特别是R-PRP血栓时易于渗入到血栓 组织内部，因此不难理解uPA与SZ51Hu-scuPA嵌合分子溶栓效率较PRP及PPP组都出现下降趋 势。在溶解含高浓度血小板的R-PRP血栓时，由于致密的血栓凝块影响了溶栓剂进入血栓组 织内部的速度导致溶解血栓的过程只能是从外向内逐步进行。但无论哪一血栓组中，融合蛋 白的溶栓率均比阳性对照组高、溶栓速度快。

　　纤维蛋白原浓度测定表明，SZ51Hu-scuPA嵌合分子在提高溶栓效率的同时，基本没有出现 纤维蛋白原过度降解致浓度下降的情况。至于在SZ51Hu-scuPA嵌合分子应用剂量达50 U/m l，溶解PPP血浆凝块时出现的纤维蛋白原浓度降低至0.96 g/L的情况，可能与在该剂量时溶栓速度快、效率高有关。从表中可知，早在溶栓的第1 小时溶栓率 已达61.8%，第 2小时83.9%，而我们检测纤维蛋白原浓度是在溶栓开始后4 h，血栓溶 解后释放至血浆中被激活的纤溶酶在此之前已开始降解纤维蛋白原，导致浓度下降的缘故。 由于本研究中，比较溶栓效率时采用的活性单位较低，在溶栓4 h检测纤维蛋白原浓度时uPA 各剂量点尚不足以大量地激活纤溶酶，因此除了产生较低的溶栓率外，也未引起纤维蛋白原 浓度的下降。本研究将为抗体导向溶栓剂的进一步临床研究提供了可靠的实验依据。

　　本课题由国家“863”高技术科学发展计划(102-09-03-02)资金资助

　　作者简介：万海英,女,45岁，主任技师，血液学、生物学博士，主要从事血栓与止 血研究;

　　阮长耿，男，60岁，院士，教授，博士生导师，主要从事血液学、血栓与止血研究

　　作者单位：李佩霞(苏州医学院 附属第一医院江苏省血液研究所血栓与止血研究室，苏州 215006)

　　阮长耿(苏州医学院 附属第一医院江苏省血液研究所血栓与止血研究室，苏州 215006)

　　4　参考文献

　　1，Wu J C,He G R,Wu G X et al.Radioimmunoimaging of experime ntal 　arterial and venous thrombi in dogs with 99mTc-labelled mono clonal anti-activated platelet antibody SZ51.Nucl Med Commun,1993:14:1088

　　2，杜鸰，余瑞荣，华子春 et al.抗人活化血小板单克隆抗体与尿激酶杂 合分子的纤溶作用.中国科学(B辑)，1993;23(1)：32

　　3，刘征辉，万海英，王　斌 et al.重组抗体-尿激酶导向溶栓剂的基因构 建及表达.生物化学与生物物理学报，1998：30(6)：601

　　4，Fraker P J,Speck L C.Protein and cell membrane iodinations with a sparingly soluble chloroamide,1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-dipheni-glycoluril.Diphenigly -coluril.Biochem Biophys Res Commun,1978;80:849

　　5，韩素文，余炜源，李秀珍 et al.培养细胞分泌的血纤维蛋白溶酶原激活 物的研究.军事医学科学院院刊，1987;10(2)：101

　　[收稿1999-06-10　修回1999-11